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槐糖脂的屬性：脂肪酸底物和混合比例的影響——材料和方法
來(lái)源：上海謂載 瀏覽 1604 次 發(fā)布時(shí)間:2021-11-17
材料和方法
材料
所有培養(yǎng)基成分均從Sigma-Aldrich化學(xué)公司購(gòu)買(mǎi)，但由Fluka Biochemika（瑞士Buchs）經(jīng)銷的酵母提取物除外，且所有溶劑均為HPLC級(jí)，并從Burdick和Jackson（密歇根州Muskegon）處購(gòu)買(mǎi)。
槐脂合成
在假絲酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基（CGM）中制備假絲酵母ATCC 22214接種物，該培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成（g/l）：葡萄糖，100；酵母抽提物，10；和尿素，1，根據(jù)先前公布的方法（Ashby等人，2005年）。在2.5升臺(tái)式發(fā)酵罐（Bioflo III間歇式/連續(xù)式生物反應(yīng)器，新澤西州新不倫瑞克）中，在2升培養(yǎng)基中進(jìn)行槐脂合成?；維L生產(chǎn)培養(yǎng)基（CGM培養(yǎng)基）由上述相同成分和相同比例組成。用濃鹽酸將pH值調(diào)至6.0，并通過(guò)高壓滅菌對(duì)CGM培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。滅菌后，將溫度平衡至26℃，并將棕櫚酸、硬脂酸、油酸或亞油酸作為脂質(zhì)共基質(zhì)以2%（w/v）的比例添加到培養(yǎng)基中，使每個(gè)培養(yǎng)基在接種前的最終pH值為5.8±0.2。添加棕櫚酸和硬脂酸作為不溶性固體，而添加油酸和亞油酸作為不混溶液體。將50 ml冷凍接種培養(yǎng)物解凍并用于接種每次發(fā)酵。生長(zhǎng)/生產(chǎn)條件如下：溫度=26-C，攪拌（葉輪轉(zhuǎn)速）=700 rpm，空氣流量=2 l空氣/分鐘，無(wú)pH控制。2天后，向發(fā)酵液中添加額外的5%（w/v）干葡萄糖和2%（w/v）脂肪酸，當(dāng)添加額外的0.5%（w/v）脂肪酸時(shí)，允許發(fā)酵持續(xù)5天。然后繼續(xù)發(fā)酵2天（發(fā)酵的總持續(xù)時(shí)間為7天）。
槐脂的分離純化
為了分離SLs，將整個(gè)培養(yǎng)物（細(xì)胞和肉湯）分成等份，并凍干（*2天）。將干燥的殘留物放入1 l錐形燒瓶中，通過(guò)在250 rpm、30-C下?lián)u晃2天，用過(guò)量的乙酸乙酯提取每部分。在整個(gè)提取過(guò)程中，定期移除50 ml乙酸乙酯，并通過(guò)TLC測(cè)試內(nèi)酯相對(duì)于開(kāi)鏈形式的優(yōu)先溶解度的可能性（過(guò)程見(jiàn)下文）。提取物通過(guò)Whatman 2號(hào)濾紙過(guò)濾，剩余固體用乙酸乙酯洗滌兩次（每次500 ml），以最大限度地提高回收率。通過(guò)蒸發(fā)濃縮含有SLs的合并乙酸乙酯餾分，并將其添加到1 l己烷中以沉淀純SLs。通過(guò)過(guò)濾從己烷中回收純SLs，并在干燥器中真空干燥以獲得細(xì)白色粉末，然后精確稱量以獲得產(chǎn)品產(chǎn)率。
槐脂分析
使用硅膠板（250 lm層厚，17 lm粒徑，60 A?孔徑（Sigma-Aldrich）和氯仿/甲醇/水（80:20:1，體積比為溶劑）通過(guò)薄層色譜法闡明SL在乙酸乙酯中的優(yōu)先溶解度和分餾。顯影劑為乙醇中的5%（w/v）磷鉬酸，然后炭化。
如前所述測(cè)定SL含量（Nun?ez等人，2001）。簡(jiǎn)言之，SL混合物通過(guò)HPLC使用Waters 2690分離模塊（Waters公司）使用15 cm 9 2.1 mm對(duì)稱C18 3.5 lm柱進(jìn)行分離。使用線性梯度洗脫法從水/乙腈（0.5%甲酸）/乙腈（50:10:40，體積比）中進(jìn)行洗脫并在25分鐘內(nèi)將其與乙腈（0.5%甲酸）/乙腈（10:90，體積比）保持5分鐘，總運(yùn)行時(shí)間為35分鐘。流速為0.25 ml/min。將流出物連接到帶有APCI探針的微型質(zhì)量ZMD質(zhì)譜儀（水）設(shè)置為正模式，每次掃描2秒，從m/z 200掃描到m/z 1000。電暈針電壓調(diào)整為3.8 kV，樣品錐20 V，提取錐2 V，用于檢測(cè)碎片和分子離子（[m]+）。
表面活性測(cè)定
在滴體積Kru–ss DVT30張力計(jì)（Kru–ss USA，北卡羅來(lái)納州夏洛特）上測(cè)量油水界面張力（IFT）。水相含有200mg表面活性劑/l，0.01M Na2SO4，0.77mm CaCl2，0.26mm MgCl2，pH值8.0。油菜（菜籽）油用作油相。在10微升油/分鐘時(shí)記錄三次測(cè)量的平均值。使用Kibron Delta-8張力計(jì)（Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）測(cè)定臨界膠束濃度（CMC）和最小表面張力（min.ST）。樣品溶液含有0.01 mNa2SO4、0.77 mM CaCl2、0.26 mM MgCl2和各種濃度的表面活性劑，pH值為8.0。所有物理性質(zhì)測(cè)量均在室溫下進(jìn)行。